Tierische Zellkulturen: Ein Methoden-Handbuch

Abkürzungsverzeichnis
1 Einführung
1.1 Geschichte der Gewebekultur
1.2 Vorteile der Gewebekultur
1.2.1 Kontrolle des Kulturmilieus
1.2.2 Charakterisierung und Homogenität der Probe
1.2.3 Wirtschaftlichkeit
1.3 Nachteile der Gewebekultur
1.3.1 Sachkenntnis und Erfahrung
1.3.2 Zellausbeute
1.3.3 Instabilität
1.4 In-vitro-Besonderheiten
1.5 Definitionen
2 Biologie der kultivierten Zelle
2.1 Kulturmilieu
2.2 Anlegen einer Zellkultur
2.3 Entwicklung von Zellinien
2.4 „Krise“ und Entstehung kontinuierlicher Zellinien
2.5 Entdifferenzierung
2.6 Was ist eine kultivierte Zelle?
2.7 Funktionelles Milieu
3 Planung und Einrichtung eines Gewebekulturlaboratoriums
3.1 Steriler Arbeitsbereich
3.2 Inkubation
3.3 Präparation und Vorbereitung
3.4 Reinigung
3.5 Aufbewahrung und Lagerung
3.6 Bauliche Gestaltung und Ausstattung
4 Laborausrüstung
4.1 Notwendige Laborausrüstung
4.1.1 Inkubatoren
4.1.2 Inkubationstemperatur
4.1.3 Dampfsterilisatoren
4.1.4 Kühl- und Tiefkühlschränke
4.1.5 Mikroskope
4.1.6 Reinigungsausrüstung
4.1.7 Heißluftsterilisatoren und Trockenschränke
4.1.8 Wasserreinigung
4.1.9 Zentrifugen
4.1.10 Kryokonservierung von Zellen
4.2 Nützliche Laborausrüstung
4.2.1 Laminarbox (Reinraumwerkbank)
4.2.2 Zellzählgeräte
4.2.3 Vakuumpumpen
4.2.4 CO2-Inkubatoren
4.2.5 Medienpräparation und Qualitätskontrolle
4.2.6 Mikroskope
4.2.7 Temperaturaufzeichnung
4.2.8 Magnetrührer
4.2.9 Rollerapparaturen
4.2.10 Pipettierhilfen und automatische Pipetten
4.2.11 Mechanische Hilfen und Automatisierung
4.3 Nützliche Zusatzgeräte
4.3.1 Tiefkühlgeräte
4.3.2 Spülmaschinen
4.3.3 Fernsehanlagen („closed-circuit television“)
4.3.4 Koloniezählgeräte
4.3.5 Zellgrößenbestimmung
4.3.6 Zeitraffer-Mikrokinematographie
4.3.7 Programmierbare Zelleinfriergeräte
4.3.8 Elutriationszentrifugen
4.3.9 Durchflußzytophotometer
4.4 Verbrauchsmaterial
4.4.1 Pipetten
4.4.2 Kulturgefäße
5 Technik des aseptischen Arbeitens
5.1 Ziele des aseptischen Arbeitens
5.2 Ruhige Zonen
5.3 Arbeitsflächen
5.4 Persönliche Hygiene
5.5 Pipettieren
5.6 Steriles Arbeiten
5.6.1 Abwischen
5.6.2 Verschließen
5.6.3 Abflammen
5.6.4 Gießen
5.7 Laminarbox (Reinraumwerkbank)
5.8 Standardprozedur des aseptischen Arbeitens
6 Sicherheit im Laboratorium und Biorisiken
6.1 Allgemeine Sicherheit
6.1.1 Glasgeräte und scharfe Gegenstände
6.1.2 Toxische Chemikalien
6.1.3 Gase
6.1.4 Flüssiger Stickstoff
6.2 Feuer
6.3 Strahlung
6.4 Biorisiken
7 Kulturbedingungen
7.1 Substrat
7.1.1 Glas
7.1.2 Einwegplastikmaterialien
7.1.3 Mikroträger
7.1.4 Sterilisation von Plastikmaterialien
7.1.5 Andersartige künstliche Substrate
7.1.6 Vorbehandelte Oberflächen
7.1.7 Feederschichten
7.1.8 Dreidimensionale Matrizes
7.1.9 Nichtadhäsive Substrate
7.1.10 Flüssig-Gel- und Flüssig-Flüssig- Grenzschichten
7.1.11 Perfundierte Mikrokapillaren
7.1.12 Kulturgefäße
7.2 Gasphase
7.2.1 Sauerstoff
7.2.2 Kohlendioxid
7.3 Medien und Supplemente
7.3.1 Physikalische Eigenschaften
7.3.2 Mediumbestandteile
7.3.3 Serum
7.3.4 Serumfreie Medien
7.4 Auswahl von Medium und Serum
7.4.1 Chargenreservierung
7.4.2 Prüfen von Serum
7.5 Sonstige Zusätze
7.6 Inkubationstemperatur
8 Vorbereitung und Sterilisation
8.1 Vorbereitung und Sterilisation von Geräten
8.1.1 Glasgeräte
8.1.2 Pipetten
8.1.3 Schraubkappen
8.1.4 Sonstige Gerätschaften
8.1.5 Alternative Sterilisationsmethoden
8.1.6 Auswahl der Detergenzien
8.2 Vorbereitung und Sterilisation von Reagenzien und Medien
8.2.1 Wasser
8.2.2 Physiologische Salzlösungen
8.2.3 Medien
8.2.4 Herstellung und Sterilfiltration sonstiger Reagenzien
8.2.5 Sterilfiltration
8.2.6 Sterilitätsprüfung
8.2.7 Wachstumstests
8.2.8 Lagerung
8.3 Gewinnung und Vorbereitung von Serum
9 Gewebedissoziation und Primärkultur
9.1 Isolierung des Gewebes
9.1.1 Mäuseembryonen
9.1.2 Hühnerembryonen
9.1.3 Menschliches Biopsiematerial
9.2 Primärkulturen
9.2.1 Kultur von Primärexplantaten
9.2.2 Enzymatische Gewebedissoziation
9.2.3 Dissoziation in warmem Trypsin
9.2.4 Trypsinierung bei 4°C
9.2.5 Organanlagen des Hühnerembryos
9.2.6 Andere enzymatische Methoden
9.2.7 Mechanische Dissoziation
9.2.8 Trennung lebender und nicht lebensfähiger Zellen
10 Haltung der Kulturen – Zellinien
10.1 Nomenklatur
10.2 Routinemethoden
10.2.1 Mediumwechsel
10.2.2 Volumen, Mediumtiefe und Oberfläche
10.2.3 Erhaltungsmedium
10.2.4 Mediumwechsel oder „Füttern“ einer Kultur
10.2.5 Subkultivierung
10.2.6 Vermehrung in Suspension
10.3 Schlechtes Zellwachstum
11 Klonierung und Selektion spezifischer Zellarten
11.1 Klonierung
11.1.1 Klonieren durch Verdünnung
11.1.2 Stimulation der Plattiereffizienz
11.1.3 Multischalen
11.1.4 Halbfeste Medien
11.1.5 Isolierung von Klonen
11.2 Selektionsmedien
11.3 Isolierung genetischer Varianten
11.4 Wechselwirkung mit dem Substrat
11.4.1 Selektive Anheftung
11.4.2 Selektives Ablösen
11.4.3 Beschaffenheit des Substrates
12 Physikalische Methoden der Zelltrennung
12.1 Methoden auf der Grundlage der Zellgröße und Sedimentationsgeschwindigkeit
12.1.1 Spontansedimentation bei 1 g
12.1.2 Elutriationszentrifugation
12.2 Methoden auf der Grundlage der Zelldichte
12.2.1 Isopyknische Sedimentation
12.3 Methoden auf der Grundlage der Fluoreszenz
12.4 Weitere Methoden
13 Charakterisierung von Zellinien
13.1 Einführung
13.1.1 Identifizierung der Spezies
13.1.2 Linien- oder gewebespezifische Merkmale
13.1.3 Unikale Marker
13.1.4 Transformation
13.2 Morphologie
13.2.1 Färbung
13.2.2 Kulturgefäße für zytologische Untersuchungen an Monolayerkulturen
13.2.3 Zytologische Untersuchungen an Suspensionskulturen
13.2.4 Photographie
13.3 Chromosomenanalyse
13.3.1 Chromosomenpräparation
13.3.2 Chromosomenbänderung
13.4 DNA-Gehalt
13.5 RNA- und Proteingehalt
13.6 Enzymaktivität
13.7 Antigenmarker
13.7.1 Indirekte Immunfluoreszenztechnik
13.7.2 Indirekte Peroxidasetechnik
13.7.3 Peroxidase-Antiperoxidase-Technik (PAP)
13.8 Differenzierung
14 Induktion der Differenzierung
14.1 Stadien der Determination und Differenzierung
14.2 Proliferation und Differenzierung
14.3 Determination und Differenzierung
14.4 Differenzierungsmarker
14.5 Induktion der Differenzierung
14.5.1 Lösliche Induktoren
14.5.2 Zelluläre Wechselwirkungen
14.5.3 Zell-Matrix-Wechselwirkungen
14.5.4 Polarität und Zellform
14.6 Differenzierung und Malignität
14.7 Praktische Aspekte
14.7.1 Präparation von Collagengel
14.7.2 BeSchichtung von Oberflächen mit vernetztem Collagen
15 Der transformierte Phänotyp
15.1 Was ist Transformation?
15.2 Anheftungsunabhängigkeit (Substratunabhängigkeit)
15.2.1 Klonierung in Suspension
15.2.2 Kontakthemmung und Dichtebegrenzung des Wachstums
15.2.3 Wachstum auf konfluenten Monolayern
15.3 Genetische Veränderungen
15.4 Zellprodukte und Serumabhängigkeit
15.4.1 Tumorangiogenesefaktor
15.4.2 Plasminogen-Aktivator
15.5 Invasives Wachstum
15.6 Tumorentstehung
16 Kontamination
16.1 Arten mikrobieller Kontamination
16.1.1 Kontrolle von Kulturen auf Mykoplasmen
16.1.2 Fluoreszenztechnik zum Nachweis von Mykoplasmen
16.1.3 Alternative Methoden zur Bestimmung von Mykoplasmen
16.2 Nachweis mikrobieller Kontamination
16.3 Kreuzkontamination
16.4 Schlußfolgerungen
17 Instabilität, Variation und Langzeitlagerung
17.1 Kulturmilieu
17.2 Selektives Wachstum, Transformation und Alterung
17.3 Genetische Instabilität
17.4 Kryokonservierung von Zellen
17.4.1 Auswahl einer Zellinie
17.4.2 Standardisierung von Medien und Serum
17.4.3 Einfrieren von Zellen
17.4.4 Auftauen der Zellen
17.5 Zellbanken
18 Quantitative Erfassung und ihre experimentelle Realisierung
18.1 Zellzählung
18.1.1 Hämozytometer
18.1.2 Elektronische Partikelzählung
18.1.3 Färbung der Monolayer
18.2 Zellmasse
18.3 DNA-Gehalt
18.3.1 Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen mit Hoechst 33258
18.3.2 Bestimmung des DNA-Gehalts von Zellen mit DAPI
18.4 Proteingehalt
18.4.1 Zellaufschluß
18.4.2 Proteinbestimmung nach Lowry
18.4.3 Proteinbestimmung nach Bradford
18.4.4 Proteinsynthese
18.4.5 DNA-Synthese
18.5 Vorbereitung von Proben für Enzym- und Immunoassays
18.6 Parallelproben
18.7 Wachstumszyklus
18.7.1 Latenzphase (lag-Phase)
18.7.2 Exponentielle Phase (log-Phase)
18.7.3 Plateauphase
18.8 Plattiereffizienz
18.9 Klonaler Wachstumstest mit der Verdünnungstechnik
18.10 Markierungsindex
18.11 Mitose-Index
18.12 Zellzykluszeit (Generationszeit)
18.13 Zytometrie
19 Zytotoxizitäts- und Vitalitätstests
19.1 Grenzen der In-vitro-Methoden
19.2 Art des Testsystems
19.2.1 Kurzzeittests (Vitalitätstests)
19.2.2 Langzeittests (Überlebenstests)
19.3 Mikrotitration
19.4 Metabolische Tests
19.5 Wechselwirkungen von Substanzen
19.6 Screening kanzerostatischer Substanzen
19.6.1 Prognostische Tests
19.6.2 Kultursysteme
19.7 Mutagenität
19.8 Karzinogenität
20 Kultivierung spezieller Zellarten
20.1 Epithelzellen
20.1.1 Epidermale Zellen
20.1.2 Mammaepithelzellen
20.1.3 Cervixepithelzellen
20.1.4 Darmepithelzellen
20.1.5 Leberparenchymzellen
20.1.6 Pankreasepithelzellen
20.1.7 Nierenepithelzellen
20.1.8 Bronchial- und Trachealepithelzellen
20.1.9 Prostataepithelzellen
20.2 Mesenchymzellen
20.2.1 Bindegewebszellen
20.2.2 Fettzellen
20.2.3 Muskelzellen
20.2.4 Knorpelzellen
20.2.5 Knochenzellen
20.2.6 Endothelzellen
20.3 Neuroektodermale Zellen
20.3.1 Neuronalzellen
20.3.2 Gliazellen
20.3.3 Endokrine Zellen
20.3.4 Melanozyten
20.4 Hämatopoetische Zellen
20.5 Keimzellen
20.6 Minimal-Deviation-Tumorzellen
20.7 Teratomzellen
21 Kultivierung von Tumorgewebe
21.1 Materialentnahme
21.2 Dissoziation
21.3 Primärkulturen
21.4 Charakterisierung
21.5 Entwicklung von Zellinien
21.6 Allgemeine Methoden
21.7 Selektionskulturen
21.7.1 Selektionsmedien
21.7.2 Selektive Substrate
21.7.3 Konfluente Feederschichten
21.7.4 Klonierung in Suspension
21.7.5 Histotypische Kulturen
21.7.6 Xenotransplantate
21.7.7 Kryokonservieren
22 Dreidimensionale Kultursysteme
22.1 Organkulturen
22.1.1 Gas- und Nährstoffaustausch
22.1.2 Strukturelle Integrität
22.1.3 Wachstum und Differenzierung
22.1.4 Grenzen der Organkultur
22.1.5 Arten von Organkulturen
22.2 Histotypische Kulturen
22.2.1 Schwammtechniken
22.2.2 Kapillarperfusion
22.2.3 Reaggregation und Sphäroide
22.2.4 Filtertechniken
23 Spezielle Techniken
23.1 Massenkulturtechniken
23.1.1 Suspensionskulturen
23.1.2 Monolayerkultur
23.2 Lymphozytenpräparation
23.2.1 Blastentransformation
23.3 Autoradiographie
23.4 Kultur von Poikilothermenzellen
23.5 Synchrone Zellkulturen
23.5.1 Zellseparation
23.5.2 Blockade des Zellzyklus
23.6 Zeitraffer-Mikrokinematographie
23.6.1 Videobandaufnahmen
23.6.2 Zeitraffer-Filmaufnahmen
23.7 Amniozentese
23.8 Fusion somatischer Zellen
23.8.1 Selektion von Hybridklonen
23.9 Gentransfer
23.10 Produktion monoklonaler Antikörper
23.11 Molekulare Hybridisierung in situ
23.12 Präparation und Nachweis von Viren
23.13 Schlußbetrachtung
24 Reagenzien
25 Zellkultur-Bedarfsartikel
25.1 Hersteller oder Lieferanten
25.2 Adressen
26 Glossar
Literaturverzeichnis
Register