Romeis Mikroskopische Technik

3827416760......Page 1
Title Page\r......Page 3
Copyright Page\r......Page 4
Autoren\r......Page 5
Benno Romeis (1888 - 1971)\r......Page 7
Vorwort der Herausgeber\r......Page 8
Table of Contents\r......Page 10
1.1.1 Die Geschichte des Mikroskops......Page 12
1.1.2 Einführung in die Physik des Lichtes......Page 13
1.1.2.2 Brechung, Beugung, Interferenz und Polarisation......Page 14
1.1.3 Die Hauptkomponenten des Mikroskops......Page 15
1.1.4 Wie entsteht die Vergrößerung......Page 17
1.1.5.1 Korrektur der chromatischen Aberration und der Bildwölbung......Page 18
1.1.5.2 Auflösung, Schärfentiefe, Arbeitsabstand......Page 19
1.1.8 Die Köhlersche Beleuchtung......Page 21
1.1.9.1 Dunkelfeld......Page 22
1.1.9.2 Phasenkontrast......Page 24
1.1.10.2 Modulationskontrast......Page 26
1.1.10.3 Differenzieller Interferenzkontrast (DIC)......Page 27
1.1.11 Stereomikroskopie......Page 29
1.1.12.2 Hauptkomponenten im Fluoreszenzmikroskop......Page 31
1.1.13 Konfokale Mikroskopie......Page 33
1.1.15 TIRF......Page 35
1.2.1.1 Die Anfänge der Elektronenmikroskopie......Page 36
1.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie......Page 37
1.2.2.1 Elektronenstrahlquelle......Page 38
1.2.2.3 Strahl-Probe-Wechselwirkungen......Page 40
1.2.2.4 Kontrastarten......Page 41
1.2.3 Elektronentomografie......Page 43
1.2.4 EFTEM......Page 44
1.2.5.1 Grundsätzlicher Aufbau und Funktionsweise......Page 45
1.2.5.2 Wechselwirkungen zwischen Elektronenstrahl und Präparat......Page 46
1.2.5.3 Detektion......Page 47
1.2.5.6 ESEM – Rasterelektronenmikroskopie unter Umgebungsbedingungen......Page 48
1.2.6.2 Rasterkraftmikroskopie......Page 49
2.1.1.1 Voraussetzungen für das Arbeiten mit Lebendpräparaten......Page 50
2.1.1.2.2 Micro-Life-Objektträger für die Untersuchung aquatischer Kleinstlebewesen......Page 51
2.1.1.2.5 Hirnschnittpräparate und Gewebekulturen......Page 52
2.1.2.2 Eigenschaften von Vitalfarbstoffe......Page 53
2.1.2.3.1 Trypanblau......Page 54
2.1.2.3.4 Neutralrot......Page 55
2.1.2.4.2 Acridinorange......Page 56
2.1.2.4.3 Fluoresceindiacetat – Aufnahme von Tracern über die Plasmamembran......Page 57
2.1.2.4.4 Zellkernfärbung am lebenden Präparat mit Hoechst und DRAQ5......Page 58
2.1.3 Live-Cell-Imaging......Page 59
2.1.3.1.1 Organellenmarker......Page 60
2.1.3.2 Calcium-Imaging......Page 61
2.1.3.3.3 Fluorescence correlation spectroscopy, FCS......Page 62
2.1.3.4 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)......Page 63
2.1.4 Neuronale Tracer und ihre Anwendungen (Neuronales Tracing)......Page 64
2.1.4.1.1 Retrograde Tracer......Page 65
2.1.4.3 Techniken zur Tracer-Applikation......Page 67
2.1.4.3.2 Druckapplikation......Page 68
2.1.4.3.3 Iontophoretische Injektion......Page 69
2.1.4.4 Perfusionskammer für in vitro-Farbstoffapplikationen......Page 71
2.1.4.5 Farbstoffapplikationen in der Interface-Kammer......Page 73
2.1.4.6.1 Fluoro Ruby (FR)......Page 76
2.1.4.6.2 Biotinylierte Dextranamine (BDA)......Page 79
2.1.4.6.3 Choleratoxin B (CtB)......Page 81
2.1.4.6.4 Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin (PHA-L)......Page 83
2.1.4.6.5 Neurobiotin, Biocytin......Page 84
2.1.4.6.6 Carbocyanine (Lucifer Yellow, DiI, DiO, DiA)......Page 87
2.2.1 Abstrichpräparate......Page 88
2.2.2.1 Ausstriche von Zellsuspensionen......Page 89
2.2.5.1 Entnahme von adhärenten Zellenaus Zellkulturen......Page 90
2.2.5.3 Zellsuspensionen von Epithelien......Page 91
2.2.6 Isolation von Gewebeteilen......Page 92
2.2.6.2.2 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Handmikrotoms......Page 93
2.2.6.2.3 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Vibratoms......Page 94
2.2.8.1 Durchflusscytometrie......Page 95
2.2.9 Lasermikrodissektion......Page 96
2.3.1.1 Ziel der Fixierung......Page 98
2.3.1.2 Fixierungsverfahren......Page 99
2.3.2.1 Fixanzien für die Histologie......Page 100
2.3.2.1.2 Ethanol und ethanolhaltige Lösungen......Page 102
2.3.2.1.6 Die HOPE-Fixierung......Page 103
2.3.2.2.1 Glutaraldehyd (GA)......Page 107
2.3.2.2.4 Osmiumtetroxid......Page 109
2.3.3.4 Osmolarität und Ionenzusammensetzung......Page 110
2.3.4 Praxis der Fixierung für die Lichtmikroskopie......Page 111
2.3.5 Praxis der Fixierung für die Elektronenmikroskopie......Page 112
2.3.6 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten......Page 113
2.3.7.2.2 Feuchtfixierung......Page 114
2.3.9 Fixierungs- und Einbettautomaten......Page 115
2.4.1.1.2 Auswaschen des Fixierungsmittels aus den Präparaten......Page 116
2.4.1.1.3 Entwässern der Präparate......Page 117
2.4.1.1.6 Ausgießen (in Blöcke gießen) der Präparate im Einbettmittel......Page 119
2.4.1.2.2 Einbettautomaten......Page 121
2.4.1.3.1 Paraffineinbettung......Page 122
2.4.1.3.2 Kunststoffeinbettung......Page 126
2.4.1.3.3 Celloidineinbettung......Page 128
2.4.1.4.1 Allgemein......Page 131
2.4.1.4.2 Messer in der Paraffinmikrotomie......Page 132
2.4.1.4.4 Stellung des Mikrotommessers beim Paraffinschneiden......Page 133
2.4.1.4.5 Mikrotomtypen......Page 134
2.4.1.4.6 Schneidetechnik am Mikrotom......Page 135
2.4.1.5.2 Beurteilung von Artefakten im Präparat......Page 136
2.4.2.1.2 Entwässerung......Page 138
2.4.2.1.3 Einbettung von Gewebeproben......Page 139
2.4.2.1.4 Einbettung von Suspensionszellen, kleinen Gewebeteilen oder -schnitten......Page 142
2.4.2.1.6 Orientierte Einbettung, Umbettung und Umorientierung von Präparaten......Page 143
2.4.2.1.8 Häufige Probleme durch Fehler bei der Entwässerung und Einbettung und mögliche Abhilfe......Page 145
2.4.2.2.1 Objektträgernetzchen (Grids)......Page 146
2.4.2.2.3 Trimmen......Page 148
2.4.2.2.4 Anfertigen und Auffangen der Schnitte......Page 149
2.4.2.2.5 Probleme bei der Ultramikrotomie und Möglichkeiten der Abhilfe......Page 152
2.5.2.1 Reinigung......Page 154
2.5.2.3 Stabilisierungen......Page 155
2.5.2.5.4 Kritische-Punkt-Trocknung......Page 156
2.5.2.6 Befestigen der Präparate......Page 157
2.5.2.7.3 Wahl des Target-Materials......Page 158
2.5.3 Artefakte......Page 159
2.6.2.1.1 Phosphorwolframat (PW)......Page 160
2.6.2.2.2 2-Schritt-Methode......Page 161
2.6.2.3 Probleme und Problemlösungen......Page 162
2.6.4 Positive Kontrastierungstechniken......Page 163
2.6.4.1.2 Schnittkontrastierung......Page 164
2.6.4.2.1 Nachweis von Ionen......Page 165
2.6.4.2.3 Nachweis von Zuckern......Page 166
2.7.1.1 Einfrieren der Probe......Page 168
2.7.1.1.3 Aufkleben und langsames Einfrieren......Page 169
2.7.1.2.1 Herstellen von Kryostatschnitten......Page 170
2.7.2.1 Kryofixierung......Page 171
2.7.2.1.1 Einfrieren bei Umgebungsdruck......Page 172
2.7.2.1.2 Einfrieren unter hohem Druck (Hochdruckgefrierfixierung)......Page 174
2.7.2.2.1 Entwässerung bei 0–4 °C......Page 178
2.7.2.2.3 Gefriersubstitution......Page 179
2.7.2.3.1 Vorbereitung der Gefrierbrucheinrichtung......Page 180
2.7.2.3.3 Gefrierbruch......Page 182
2.7.2.3.5 Replizieren der Bruchoberfläche......Page 183
2.7.2.4 Kryoschneiden......Page 184
2.8 Literatur......Page 185
3.2.2 Klassifizierung von Farbstoffen......Page 191
3.2.4 Ladung der Farbstoffe......Page 192
3.2.6 Färbevokabular......Page 194
3.2.7 Färbetheorien......Page 195
3.2.7.4 Theorie der indirekten Färbungen (Beizen)......Page 196
3.4.2 Färbebänke, Tropfflaschen und sonstiges Zubehör......Page 197
3.4.3.3 programmierbarer Universalfärbeautomat......Page 198
3.5.1.2 Schnittmontage und Trocknung......Page 199
3.5.1.3.3 Poly-L-Lysin......Page 200
3.5.2.3 Kunststoffschnitte......Page 201
3.5.2.4 Fixierungsniederschläge und deren Entfernung......Page 202
3.5.3.2 Einschließen der Präparate......Page 203
3.5.3.2.1 Einschlussmittel für wasserfreie Präparate......Page 204
3.5.3.2.2 Einschlussmittel für wasserhaltige Präparate......Page 205
3.5.3.4 Behandlung verblasster Präparate......Page 207
3.6 Färbemethoden......Page 208
3.6.1.3 Hämalaune......Page 209
3.6.1.3.1 Saures Hämalaun n. Mayer (1920)......Page 210
3.6.1.3.3 Hämalaun n. Delafield (1885)......Page 211
3.6.1.4 Färben mit Hämalaunlösungen......Page 212
3.6.1.5 Eisenhämatoxyline......Page 213
3.6.1.6 Weitere Kernfärbungen......Page 214
3.6.2 Cytoplasmafarbstoffe und Cytoplasmafärbungen......Page 215
3.6.4.1 Allgemeines......Page 217
3.6.4.3 Bleichen der Pigmente mit H2O2......Page 218
3.6.4.4.1 Argentaffine Reaktion......Page 219
3.6.5 Basophilie......Page 220
3.6.6 Metachromasie......Page 221
3.6.7 Übersichtsfärbungen......Page 223
3.6.9.1 Trichromfärbungen......Page 225
3.6.9.2.1 Komponenten des elastischen Fasersystems......Page 229
3.6.9.2.2 Färbung von Mikrofibrillen der elastischen Fasern und Oxytalanfasern......Page 230
3.6.9.3 Darstellung von retikulären Bindegewebsfasern......Page 233
3.6.10.1 Kohlenhydrate......Page 236
3.6.10.1.1 Alcianblaufärbungen......Page 238
3.6.10.1.2 Enzymverdauung......Page 240
3.6.10.1.3 Glykogen......Page 241
3.6.10.1.4 Nachweis von Kohlenhydraten und Glykokonjugaten mit Hilfe von Lektinen......Page 243
3.6.10.2 Amyloid......Page 245
3.6.10.4 Lipide......Page 247
3.6.10.5 Eisen......Page 249
3.6.10.6 Calciumsalze (Kalk)......Page 251
3.6.11 Nachweis von DNA  (Desoxyribonucleinsäure)......Page 252
3.6.12 Darstellung von Bakterien, Pilzen, und Protozoen im histologischen Schnitt......Page 253
3.6.13 Darstellung von Blutzellen im histologischen Schnitt......Page 258
3.6.14.1 Färbung von Kern- und Nissl-Substanz......Page 260
3.6.14.2 Darstellung von Nerven- und Gliazellen einschließlich ihrer Fortsätze......Page 261
3.6.14.3 Darstellung von Neurofibrillen mit Silberimprägnationsverfahren......Page 266
3.6.14.4 Darstellung der Markscheiden (Myelinscheiden)......Page 270
3.6.14.5 Darstellung degenerierender markhaltiger Nervenfasern......Page 274
3.6.14.6.1 Osmierung......Page 275
3.6.14.7 Darstellung von Gliazellen......Page 276
3.6.15.1 Allgemeines......Page 277
3.6.15.3 Färben ohne Entfernen des Kunststoffs aus dem Schnitt......Page 278
3.6.16 Stückfärbung......Page 279
3.6.17.1 Allgemeines und Zellentnahmeverfahren......Page 280
3.6.17.2.4 Blutausstriche......Page 281
3.6.17.3 Fixierung......Page 282
3.6.17.4 Färbemethoden......Page 283
3.6.17.4.1 Alternative Färbemethoden......Page 286
3.7 Artefakte......Page 291
3.8.1.2 Gelatineinjektionen......Page 292
3.8.2 Korrosionspräparate......Page 294
3.9 Einsatz der Polarisationsmikroskopie für die medizinische Diagnostik......Page 296
3.9.1 Grundlagen der Polarisationsmikroskopie......Page 297
3.9.2.1 Die Bedeutung der durch Kongorotfärbung verursachten Anisotropie in der Histologie......Page 298
3.9.2.2 Metachromasie als inverse topo-optische Färbungsreaktion (Toluidinblau-Präzipitations-Methode nach Romhányi 1963)......Page 299
3.9.2.3 Aldehyd-Bisulfit -Toluidinblau-(ABT)-Rektion, Permanganat-Toluidin-blau- (PBT)-Reaktion und Sialinsäurespezifische topo-optische Reaktion......Page 301
3.10 Literatur......Page 303
4.1.1 Paraffineinbettung von großen Objekten......Page 308
4.1.2.1 Zentralnervensystem......Page 309
4.1.2.2 Sinnesorgane......Page 310
4.1.2.3 Respirationstrakt......Page 312
4.1.2.4.2 Spezielle harte Differenzierungen der Epidermis......Page 313
4.1.2.5.2 Männliche Geschlechtsorgane, Spermien......Page 314
4.1.2.6.1 Vögel......Page 316
4.1.2.6.2 Säugetiere......Page 317
4.2.1 Allgemeines......Page 318
4.2.3.1 Allgemeines......Page 319
4.2.4 Entkalkung......Page 320
4.2.4.2 Entkalkungszeit......Page 321
4.2.4.5.1 Salpetersäure......Page 322
4.2.5.1 Allgemeines......Page 323
4.2.6.1 Handschleiftechnik......Page 324
4.3 Literatur......Page 325
5.2.2 Wahl des Präparates......Page 326
5.2.3.3 Lufthaltige Objekte......Page 327
5.2.4.3 Ethanol-Eisessig-Gemische......Page 328
5.3.2.2 Physikalische und chemische Mazeration......Page 329
5.4.2.1 Handschnitte......Page 330
5.4.2.3 Schlittenmikrotome......Page 331
5.4.3.2 Färbemethoden......Page 332
5.5 Ausgewählte Färbevorschriften......Page 333
5.6 Hämatoxylinlösungen......Page 339
5.7.1.3 Hydromatrix......Page 345
5.8 Literatur......Page 346
6.2 Besonderheiten der Untersuchung......Page 348
6.2.3 Vital- und Supravitalfärbungen......Page 351
6.2.5 Vorfixierung („Räucherungsmethoden“)......Page 352
6.2.6 Fixieren......Page 356
6.2.7 Vorbehandlung von Weich-und Hartsubstanzen\r......Page 359
6.2.8.1 Protozoen, heterotrophe eukaryotische Einzeller......Page 360
6.2.8.2 Evertebrata, Wirbellose......Page 364
6.3 Literatur......Page 369
7.1 Allgemeines......Page 371
7.3.1 Färbung mit Milchsäure-Orcein......Page 372
7.3.3 Q-Bänderung mit Hoechst 33258......Page 373
7.3.6 G-Bänderung mit Giemsa-Färbung......Page 374
7.5.2 Dansylchlorid......Page 375
7.7 Literatur......Page 376
8.1.1.1 Fixierung......Page 378
8.1.1.3 Inkubationsmedien......Page 379
8.2.1.1 Alkalische Phosphatase......Page 380
8.2.1.2 Saure Phosphatase......Page 382
8.2.1.3 Glukose-6-Phosphatase......Page 383
8.2.1.4 Adenosintriphosphatasen (ATPasen)......Page 384
8.2.2.2 Cholinesterasen......Page 385
8.2.3.2 Peroxidase......Page 387
8.2.3.3 Katalase......Page 388
8.2.4.1 Bernsteinsäuredehydrogenase (Succinatdehydrogenase)......Page 389
8.2.5.1 Glykogenphosphorylase (nach C. Sewry)......Page 390
8.2.6.1 Carboanhydrase (Carbonat-Dehydratase)......Page 391
8.3 Literatur......Page 392
9.1.1 Grundlagen......Page 393
9.1.3 Ähnliche Nachweissysteme......Page 394
9.2.1 Herstellung von Antikörpern......Page 395
9.2.2 Reinigung von Antikörpern......Page 398
9.3.1 Direkte und indirekte Immunmarkierung......Page 399
9.3.3 Indirekte Immunmarkierung über Protein A......Page 400
9.3.5 Lokalisation mehrerer Antigene......Page 401
9.3.6 Detektion......Page 402
9.3.8 Tyraminkatalysierte Signalverstärkung......Page 407
9.4.2 Markierung an Schnitten......Page 408
9.4.3 Durchführung der Immunmarkierung......Page 409
9.5.1 Antigendemaskierung......Page 412
9.5.3 Verminderung der Autofluoreszenz......Page 414
9.6.1 Affinitätsreinigung von Antikörpern......Page 415
9.6.2.1 Wiederherstellung der Antigenität von Schnittpräparaten für die Lichtmikroskopie nach Fixierung in Formaldehyd und Paraffineinbettung......Page 416
9.6.2.2 Antigendemaskierung für die Immunelektronenmikroskopie......Page 417
9.6.3 Immunhistologische Markierungen......Page 418
9.6.5 Immunmarkierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie......Page 419
9.6.7 Reduktion der Autofluoreszenz......Page 420
9.6.8 Herstellung von Einbettmedien für Fluoreszenzpräparate......Page 421
9.7 Literatur......Page 422
10.1.1 Prinzip......Page 424
10.1.2 DNA:DNA-in-situ-Hybridisierung......Page 425
10.1.3 RNA:RNA-in situ-Hybridisierung......Page 427
10.2.1 DNA-Sonden......Page 428
10.2.2 RNA-Sonden......Page 429
10.3 Markierung der Sonden......Page 430
10.5 Präparation von Chromosomen und Zellkernen......Page 431
10.8.1 Spezifität der Hybridisierung......Page 432
10.8.4 Hybridisierungskinetik......Page 433
10.9.1 Ausstattung......Page 434
10.10 Arbeitsvorschriften......Page 435
10.11 Probleme und Fehlerquellen......Page 450
10.12 Literatur......Page 452
11.2 Generelle Methodik des Tissue-Printing (geeignet für festes Pflanzengewebe)......Page 454
11.4 Nachweise an Tissue-Prints......Page 456
11.4.2 Western-Tissue-Print......Page 457
11.4.3 Northern-Tissue-Print......Page 458
11.4.4 Lokalisation von Enzymaktivität am Tissue-Print......Page 459
11.5 Literatur......Page 460
12.1.1 Enzymatische und lichterzeugende Reporter......Page 461
12.1.3 Zur Geschichte der FP......Page 463
12.1.4 Grundlegendes zu fluoreszierenden Proteinen......Page 464
12.2.1.2 Wichtige cis-Elemente: Promotoren und Enhancer......Page 467
12.2.2 Transiente und stabile Genexpression......Page 468
12.2.3 Fluoreszenzmikroskopie Analyse......Page 470
12.3 Literatur......Page 472
13.2.1 Digitale Kameras......Page 473
13.2.2 Erstellung der Helligkeitswerte aus einem mikroskopischen Bild......Page 474
13.2.3 Das Nyquisttheorem......Page 475
13.2.5 Kalibrierung......Page 476
13.2.6 Bildformate und Komprimierung......Page 477
13.3.1.2 Verwendung einer Zählkammer......Page 478
13.3.2.3.2 Extended Depth of Focus (EDF)......Page 480
13.4.1 Motorische Komponenten......Page 482
13.4.2 Mehrdimensionale Mikroskopie......Page 483
13.5.1.1 Aufnahme fluoreszenzmikroskopischer Bilder......Page 484
13.5.1.2 Korrekturmechanismen nach der Bildaufnahme......Page 485
13.5.3 Untersuchung der Proteindynamik in lebenden Zellen mit Hilfe fluoreszierender Proteine......Page 486
13.5.4 FRET......Page 488
13.5.5 Quantitative und qualitative Analyse des Fluoreszenzspektrums......Page 490
13.5.6 Quantitative Analyse von Ionenkonzentrationen/Ratio Imaging......Page 491
13.6 Bezugs- und Informationsquellen für Software und Analysemodule......Page 492
13.7 Literatur......Page 493
14.2 Allgemeines und Grundsätzliches......Page 494
14.5 Persönliche Schutzausrüstung......Page 495
14.9.2 Aufbewahrung, Umgang und Transport von Gefahrstoffen......Page 496
14.9.7 Betriebsanweisung......Page 499
14.12 Brandschutz......Page 501
14.14 Literatur......Page 502
Anhang 1 Tabellen\r......Page 503
Anhang 2 Aktuelle Bücher zur Mikroskopie \r......Page 521
Anhang 3 Liste der Anleitungen\r......Page 524
Index\r......Page 531