Principles and Practice of Bioanalysis1

Book Cover......Page 1
Half-Title......Page 2
Title......Page 3
Copyright......Page 4
Contents......Page 5
Contributors......Page 19
Preface......Page 20
1.1.3 Enrichment of drugs and metabolites......Page 22
1.2.1 Energy changes on solution......Page 23
Ionic bonds and ‘salting-out’......Page 24
Hydrogen bonds......Page 26
Van der Waals forces......Page 27
1.2.3 Water miscibility and water immiscibility......Page 29
1.3.1 Extraction efficiency......Page 30
1.4.1 Ionisation, pH and pK......Page 31
1.4.2 Titration curves......Page 33
1.4.3 Henderson-Hasselbalch equation......Page 34
1.4.4 Buffers......Page 36
1.4.5 Distribution coefficient......Page 37
1.5.1 Choice of solvent......Page 38
1.5.2 Mixed solvents......Page 40
1.5.5 Artefacts arising during the extraction of drugs and metabolites......Page 41
1.5.6 Modification and derivatisation of drugs and metabolites......Page 44
1.6 The ‘first law of drug metabolism’......Page 46
1.7 Bibliography......Page 47
2.1 Introduction......Page 48
2.3.1 Solvation......Page 50
2.3.2 Non-polar......Page 51
2.3.4 Ion exchange......Page 52
2.3.5 Covalent......Page 53
2.3.6 Mixed-mode interactions......Page 54
2.3.7 Polymeric sorbents......Page 55
2.4.3 Solid samples......Page 56
2.5 Developing SPE methods......Page 57
2.7 Disc cartridges......Page 58
2.7.2 Disadvantages......Page 59
2.9 Direct injection of plasma......Page 60
2.11 Conclusions and future perspectives......Page 61
2.12 Bibliography......Page 62
3.2 Applications......Page 64
3.3.1 Column......Page 65
3.3.2 Plumbing......Page 67
3.3.3 Pumps......Page 68
3.3.4 Injectors......Page 69
3.4.1 Basic principles......Page 70
3.4.3 Distribution......Page 71
3.4.4 Theoretical plates......Page 72
3.5.1 Retention......Page 73
3.5.2 Resolution......Page 74
Skewed peaks......Page 77
Band broadening......Page 79
3.5.4 Effect of temperature......Page 80
3.5.5 Effect of flow rate and linear velocity......Page 81
3.5.6 Effect of sample volume......Page 82
3.6.1 Normal phase......Page 83
3.6.2 Reverse phase......Page 84
3.6.3 Gradient reverse phase......Page 87
3.6.4 Ion suppression and ion pairing......Page 88
3.6.6 Others......Page 91
3.7 Column care......Page 92
3.8 Bibliography......Page 93
4.2 System parameters......Page 94
4.3 Reverse-phase HPLC......Page 95
4.4 Ion-pair HPLC......Page 100
4.5 Ion-exchange HPLC......Page 104
4.6 Normal-phase HPLC......Page 106
4.7.1 Chiral columns......Page 109
4.7.2 Diastereoisomers......Page 112
4.7.4 Chiral summary......Page 114
4.8 Column switching in HPLC......Page 115
4.9 Gradient reverse-phase HPLC......Page 118
4.10 Column conditions......Page 119
4.13 Glossary......Page 121
References......Page 122
5.1 Introduction......Page 124
5.2.1 Solute-property detectors......Page 125
5.3 Selectivity in detectors......Page 126
5.4.1 Linearity......Page 127
5.4.2 Time constant......Page 128
Principle of operation......Page 129
Design......Page 130
Advantages of UV-visible detectors......Page 132
Principles......Page 133
Design and use......Page 134
Advantages......Page 136
Other considerations......Page 137
Dynamic detectors......Page 138
5.5.4 Multifunctional detectors......Page 139
Principles......Page 140
Optical activity......Page 141
Nitrogen detectors......Page 142
5.6.2 Pre-column derivatisation......Page 143
5.7 Selectivity......Page 144
5.8.3 Baseline instability......Page 145
5.10 Bibliography......Page 146
6.1 Why gas chromatography works......Page 148
6.2 Factors that affect the chromatography......Page 149
6.3.1 Stationary phase......Page 150
6.3.3 Column length......Page 152
6.3.5 Film thickness......Page 153
6.3.8 Some rules of thumb......Page 154
6.4 GC hardware......Page 155
6.4.2 Sample introduction......Page 156
Splitless injection......Page 157
Direct on-column injection......Page 158
Thermionic detector (TID)......Page 161
Electron capture detector......Page 162
6.5 Derivatisation for GC......Page 163
6.7 Bibliography......Page 164
7.1 Introduction......Page 165
7.2.1 Preparative TLC......Page 166
7.2.2 Metabolic profiling......Page 167
Conjugates are relatively polar on TLC.......Page 171
7.4 Detection of compounds on TLC plates......Page 174
7.5 Bibliography......Page 175
8.2 How capillary electrophoresis works......Page 176
8.3.2 Free-solution capillary electrophoresis......Page 178
Choice of buffer and ionic strength......Page 179
8.3.3 Micellar electrokinetic capillary chromatography......Page 180
8.3.4 Electrochromatography (electrically driven HPLC)......Page 181
Gravimetric (syphonic)......Page 182
Differential pressure......Page 183
Electrochemical detection......Page 184
8.5 Use in bioanalysis......Page 185
8.6 Bibliography......Page 186
9.2 Definitions......Page 187
9.3.1 Mass action......Page 188
9.3.2 Competitive assays......Page 189
9.3.3 Non-competitive assays......Page 190
9.4.2 Label......Page 191
Enzymes......Page 192
Dextran-coated charcoal......Page 193
Immobilisation......Page 194
Typical immunisation protocol......Page 195
Radioimmunoassays......Page 196
DELFIA......Page 197
9.6.2 Fitting......Page 198
9.6.3 Precision profile......Page 199
9.7.4 Ease......Page 200
9.8.3 Matrix effects......Page 201
9.10 Immunoassay strategy......Page 202
9.12 Affinity chromatography......Page 204
Soft gel supports......Page 206
Rigid supports......Page 207
Biospecific desorption......Page 208
9.13.1 Phage libraries for antibodies......Page 209
9.14 Summary......Page 210
9.15 Bibliography......Page 211
10.1 Introduction......Page 213
10.2.1 SPE......Page 214
10.2.4 Liquid-handling procedures......Page 215
10.3 Simple automation......Page 216
10.4 Column switching......Page 217
10.6 Benchtop instruments—sequential sample processing......Page 219
10.6.2 Gilson ASPEC XL™......Page 220
10.6.3 Hamilton MicroLab™......Page 221
10.7.3 Multiple probe liquid-handling robots......Page 222
10.9 Full robotic systems......Page 224
10.11 Example methods......Page 225
10.13 Bibliography......Page 226
11.2.1 Septum inlet......Page 229
11.2.3 GC inlets......Page 230
11.2.4 LC inlets......Page 231
Particle-beam inlet......Page 232
Other inlets......Page 233
11.3.1 Introduction......Page 234
11.3.2 Electron impact ionisation......Page 235
11.3.3 Chemical ionisation......Page 236
11.3.4 Atmospheric-pressure chemical ionisation......Page 237
11.3.5 Fast atom bombardment......Page 238
Ion evaporation......Page 239
11.3.7 Electrospray......Page 241
11.3.8 Other desorption techniques......Page 243
11.4.1 Single-focusing magnetic instruments......Page 244
11.4.3 Quadrupole analysers......Page 246
11.4.4 Time of flight (ToF) analysers......Page 248
11.4.5 Ion-trap mass analysers......Page 249
11.5 Detectors......Page 250
11.5.2 Negative-ion detection......Page 251
11.6.2 Data acquisition/preliminary data processing......Page 252
Total-ion current (TIC) chromatogram......Page 253
Mass chromatography......Page 254
11.7 Bibliography......Page 256
12.1.1 Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)......Page 258
Research/discovery......Page 259
12.2 Internal standardisation......Page 260
12.3.2 Mass analysis......Page 261
12.3.3 Calculation of the mass of the selected ion......Page 262
12.4 Developing a quantitative method......Page 263
12.5 Analysis of prostanoids by GC-MS......Page 264
12.6 An example of thermospray LC-MS......Page 267
12.7 Examples of API LC-MS......Page 268
12.9 Bibliography......Page 271
13.2 Introduction......Page 273
13.3.2 Instrumentation......Page 274
Product ion mass spectrum......Page 276
Precursor ion mass spectrum......Page 280
Neutral loss mass spectrum......Page 281
13.4 Isotopically labelled compounds in metabolite identification......Page 283
13.5.1 Introduction......Page 284
Direct-probe analysis......Page 286
Particle-beam liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)......Page 287
13.5.3 Fast atom bombardment......Page 288
13.5.4 Thermospray liquid chromatography-mass sectrometry (TSP LC-MS)......Page 289
13.5.5 Electrospray liquid chromatography-mass spectrometry......Page 291
13.5.6 Ion-trap mass spectrometry coupled to external atmospheric-pressure ionisation sources......Page 292
13.5.7 Summary......Page 293
13.6 Bibliography......Page 294
14.2 Basic theory of the NMR phenomenon......Page 296
14.3.1 Chemical shift......Page 298
14.3.2 Spin-spin coupling......Page 299
14.4.1 Types of spectrometer......Page 304
14.4.2 Sample preparation......Page 305
14.5.2 Solid-phase extraction sample preparation......Page 306
14.5.4 Fluorinated compounds......Page 309
14.6 Plasma metabolites......Page 311
14.9.1 Why use pulse NMR?......Page 312
Spectral editing......Page 314
Homonuclear 2-dimensional correlation spectroscopy (COSY)......Page 315
14.9.5 Conclusion......Page 318
14.10 Bibliography......Page 319
15.1.1 Choice of label......Page 320
15.2 Stage 2: animal experiments......Page 321
15.3 Stage 3: metabolite isolation and characterisation......Page 322
15.3.1 Enrichment......Page 323
15.3.2 Analysis......Page 325
15.3.3 Separation......Page 326
Changing the mobile phase......Page 328
Changing the stationary phase......Page 330
Changing the pH......Page 332
15.3.5 Characterisation......Page 333
15.4 Stage 4: identification of metabolites......Page 339
15.4.1 Mass spectrometry......Page 341
15.4.2 NMR......Page 344
15.4.3 Degradation, derivatisation and comparison with authentic material......Page 346
15.5.3 Quantitative measurement of metabolic profiles......Page 349
15.6 In vitro studies......Page 352
15.6.1 Isolation of metabolites from in vitro incubations......Page 353
15.6.2 Cross-species comparisons of metabolic profiles......Page 355
15.7 Identification of plasma metabolites......Page 356
15.8 Good laboratory practice......Page 358
15.9 Conclusions......Page 359
16.1 Introduction......Page 360
16.2 Preliminary requirements......Page 361
16.3 Detection......Page 363
16.4 Separation......Page 365
16.5 Sample preparation......Page 366
16.7 Extraction sequence......Page 367
16.8 Liquid/liquid extraction......Page 369
16.9.2 Standardisation......Page 371
16.9.4 Calibration check......Page 372
16.10 Validation......Page 373
Stability of extracts......Page 374
16.12 Conclusions......Page 375
Index......Page 377