Hidden Treasures in Contemporary RNA Sequencing

پیشرفت‌ها در فناوری‌های توالی‌یابی RNA (RNA-seq) فرصتی بی‌سابقه برای کشف چشم‌انداز بیان ژن در افراد، بافت‌ها و محیط‌ها با پروفایل کارآمد توالی‌های RNA موجود در نمونه‌ها فراهم کرده است. هنگامی که یک توالی ژنوم مرجع یا رونوشت نمونه در دسترس است، پروتکل های تجزیه و تحلیل RNA-seq مبتنی بر نقشه برداری، خواندن های RNA-seq را با توالی های مرجع تراز می کنند، رونوشت های جدید را شناسایی می کنند، و فراوانی رونوشت های بیان شده را تعیین می کنند. نقشه به مرجع انسانی، که به عنوان خوانده های نقشه برداری نشده شناخته می شود، یک خروجی بزرگ و اغلب نادیده گرفته شده از آنالیزهای استاندارد RNA-seq است. حتی در آزمایش‌هایی که با دقت اجرا شده‌اند، قرائت‌های نقشه‌برداری نشده می‌توانند بخش قابل‌توجهی از مجموعه کامل خواندن‌های تولید شده را تشکیل دهند و می‌توانند به دلیل توالی‌بندی فنی تولید شده توسط کپی‌های با کیفیت پایین و مستعد خطا از توالی RNA نوپای نمونه‌برداری شده، ایجاد شوند. همچنین می‌تواند به دلیل رونوشت‌های ناشناخته، توالی‌های گیرنده سلول‌های B و T دوباره ترکیب شده، عدم تطابق A-to-G از ویرایش A-to-I RNA، ترانس اسپلایس، همجوشی ژن، RNA های حلقوی، و وجود غیر میزبان، خوانش‌ها بدون نقشه باقی بمانند. توالی RNA (به عنوان مثال موجودات باکتریایی، قارچی و ویروسی). خواندن های نقشه برداری نشده منبعی غنی برای مطالعه مخزن های گیرنده سلول های B و T و سیستم میکروبیوم انسانی - بدون متحمل شدن هزینه توالی یابی هدفمند اضافی است. این کتاب پروتکل مبدا خواندن (ROP) را معرفی و توصیف می کند، ابزاری که منشا را شناسایی می کند. از هر دو خواندن نقشه برداری و بدون نقشه. این پروتکل ابتدا خواندن های انسانی را با استفاده از یک الگوریتم استاندارد با توان عملیاتی بالا شناسایی می کند تا آنها را بر روی ژنوم مرجع و رونوشت نگاشت کند. پس از تراز کردن، خوانده‌ها به دسته‌های ژنومی (مانند CDS، UTRs، اینترون‌ها) و تکراری (مانند SINE، LINEs، LTRs) گروه‌بندی می‌شوند. بقیه پروتکل ROP، خواندن های بدون نقشه باقی مانده را مشخص می کند، که نتوانستند به دنباله های مرجع انسانی نگاشت شوند.

Advances in RNA-sequencing (RNA-seq) technologies have provided an unprecedented opportunity to explore the gene expression landscape across individuals, tissues, and environments by efficiently profiling the RNA sequences present in the samples. When a reference genome sequence or a transcriptome of the sample is available, mapping-based RNA-seq analysis protocols align the RNA-seq reads to the reference sequences, identify novel transcripts, and quantify the abundance of expressed transcripts.The reads that fail to map to the human reference, known as unmapped reads, are a large and often overlooked output of standard RNA-seq analyses. Even in carefully executed experiments, the unmapped reads can comprise a considerable fraction of the complete set of reads produced, and can arise due to technical sequencing produced by low-quality and error-prone copies of the nascent RNA sequence being sampled. Reads can also remain unmapped due to unknown transcripts, recombined B and T cell receptor sequences, A-to-G mismatches from A-to-I RNA editing, trans-splicing, gene fusion, circular RNAs, and the presence of non-host RNA sequences (e.g. bacterial, fungal, and viral organisms). Unmapped reads represent a rich resource for the study of B and T cell receptor repertoires and the human microbiome system—without incurring the expense of additional targeted sequencing.This book introduces and describes the Read Origin Protocol (ROP), a tool that identifies the origin of both mapped and unmapped reads. The protocol first identifies human reads using a standard high-throughput algorithm to map them onto a reference genome and transcriptome. After alignment, reads are grouped into genomic (e.g. CDS, UTRs, introns) and repetitive (e.g. SINEs, LINEs, LTRs) categories. The rest of the ROP protocol characterizes the remaining unmapped reads, which failed to map to the human reference sequences.