Application of Selected Reaction Monitoring to Highly Multiplexed Targeted Quantitative Proteomics: A Replacement for Western Blot Analysis

یک آزمایش کلیدی در تحقیقات زیست‌پزشکی، نظارت بر بیان پروتئین‌های مختلف به منظور تشخیص تغییراتی است که در سیستم‌های بیولوژیکی در شرایط آزمایشی مختلف رخ می‌دهد. روشی که بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد آنالیز وسترن بلات است. در حالی که وسترن بلات یک اسب کاری در آزمایشگاه هایی است که بیان پروتئین را مطالعه می کند و دارای چندین مزیت است، همچنین دارای تعدادی محدودیت قابل توجه است. به طور خاص، روش نیمه کمی با محدوده دینامیکی محدود است. وسترن بلات بر روی یک پروتئین در هر نمونه تمرکز می کند که تنها تعداد کمی از نمونه های نماینده در یک آزمایش تجزیه و تحلیل شده است. ابزارهای کمی جدید برای مدتی حداقل برای تکمیل و احتمالا جایگزینی وسترن بلات مورد نیاز بوده است. روش های طیف سنجی جرمی شروع به رقابت با وسترن بلات برای تجزیه و تحلیل کمی معمولی پروتئین ها کرده اند. یکی از این روش ها مبتنی بر تکنیک طیف سنجی جرمی پشت سر هم پایش واکنش انتخابی (SRM) است که به آن نظارت بر واکنش چندگانه (MRM) نیز گفته می شود. نظارت بر واکنش انتخابی در واقع یک تکنیک طیف‌سنجی جرمی پشت سر هم قدیمی‌تر است که برای اولین بار در اواخر دهه 70 توصیف شد و به طور گسترده در تجزیه و تحلیل کمی مولکول‌های کوچک مانند داروها و متابولیت‌ها استفاده می‌شود. استفاده از نظارت بر واکنش انتخابی برای تجزیه و تحلیل کمی پروتئین ها دارای تعدادی مزیت است. مهمتر از همه، اساسا کمی با دامنه دینامیکی گسترده است. خروجی تجزیه و تحلیل یک نتیجه عددی است که می تواند در چندین مرتبه بزرگی باشد. مزایای دیگر شامل ویژگی و حساسیت کافی برای تشخیص پروتئین های کم فراوانی در مخلوط های پیچیده است. در نهایت، نظارت بر واکنش انتخاب شده را می توان چندگانه کرد تا امکان تجزیه و تحلیل کمی تعداد نسبتاً زیادی پروتئین در یک نمونه واحد در یک آزمایش واحد را فراهم کند. این مختصر جزئیات تئوری و تجربی آزمایش نظارت بر واکنش انتخابی را همانطور که برای پروتئین ها اعمال می شود توضیح می دهد.

A key experiment in biomedical research is monitoring the expression of different proteins in order to detect changes that occur in biological systems under different experimental conditions. The method that is most widely used is the Western blot analysis. While Western blot is a workhorse in laboratories studying protein expression and has several advantages, it also has a number of significant limitations. In particular, the method is semi-quantitative with limited dynamic range. Western blot focuses on a single protein per sample with only a small number of representative samples analyzed in an experiment. New quantitative tools have been needed for some time to at least supplement, & possibly replace, the Western blot. Mass spectrometric methods have begun to compete with Western blot for routine quantitative analyses of proteins. One of these methods is based on the tandem mass spectrometry technique of selected reaction monitoring (SRM), which is also called multiple reaction monitoring (MRM). Selected reaction monitoring is actually an older tandem mass spectrometry technique, first described in the late 70s, that is widely utilized in the quantitative analysis of small molecules like drugs & metabolites. The use of selected reaction monitoring for the quantitative analysis of proteins has a number of advantages. Most importantly, it is fundamentally quantitative with a wide dynamic range. The output of the analysis is a numerical result that can range over several orders of magnitude. Other advantages include sufficient specificity & sensitivity to detect low abundance proteins in complex mixtures. Finally, selected reaction monitoring can be multiplexed to allow the quantitative analysis of relatively large numbers of proteins in a single sample in a single experiment. This Brief will explain both the theoretical & experimental details of the selected reaction monitoring experiment as it is applied to proteins. ​